分子和细胞相互作用仪

  • KinExA 4000
KinExA 4000

KinExA 4000

  • 产品描述:新药研发成本动辄数十上百亿美元,灵敏可靠的仪器在研发早期即可协助准确甄选苗头候选药物(hit),减少不必要的支出,降低研发风险。由于KinExA可在生理条件下获取准确可靠的结合常数,具有很高生物相关性,而且成本极低,目前被很多顶级制药公司用作主要的验证工具。此外,KinExA特有的分析软件可以轻松地解读候选分子的结合特征,节省研究人员的时间,增加结果的可靠性。
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Sapidyne Instruments Inc.1995年在美国创立,产品基于独特的Kinetic Exclusion AssayKinExA®)专利技术。Sapidyne这个名字来源于拉丁语“Sapid”,意味着令人愉悦的想法,而“dyne”则是希腊语力量的意思。 所以Sapidyne意味着一种在智力上令人愉悦的力量。

在公司成立早期,Xavier大学、美国陆军和环境保护局等研究单位采用KinExA技术开展了大量工作;经过数十年在生物制药领域、科研领域及环境监测领域的广泛应用,KinExA技术已成为顶级制药公司和生物技术公司以及许多大学、独立研究实验室和环境监测机构研究相互作用和生物活性物质检测的必备工具,并且得到FDAEMA认可。
Sapidyne总部位于美国爱达荷州博伊西,运营机构遍布全球。 公司持续开发独特的应用,不断推进KinExA®技术的发展。 随着公司发展,我们将持续重视客户的支持和学习。 凭借20多年累积的经验,KinExA技术能充分满足科学研究、药物开发、细胞治疗和环境监测领域的广泛应用。




Kinetic Exclusion Assay(KinExA®)专利技术


一、平衡态检测


在实验过程中,一种结合分子浓度恒定(Constant Binding Partner,CBP),另外一种浓度梯度分子(Titrant)与CBP混匀孵育;同时用Titrant包被磁珠。

A.浓度梯度Titrant与CBP                         B. 加入抗CBP的荧光抗体,               C. 清洗掉非特异荧光

混合物流过流路,游离的                           荧光信号随抗体结合到                     信号,只剩与CBP特异

CBP被流路中磁珠上的                               CBP上而增加。                              结合的荧光抗体,测定

Titrant捕获。                                                                                                最终特异性信号。

Titrant浓度梯度与游离CBP(即End Signal)                                      仪器记录实时结合(A-C)曲线,并自动

作图—游离CBP与Titrant的量有关,Titrant                                        将荧光信号转变为电信号;最终特异性

浓度越高游离CBP越少,信号越低;拟合                                           信号(End Signal)用于曲线拟合。

该曲线可获得Kd与CBP活性浓度。


二、动力学检测

采用平衡态检测中已包被Titrant的磁珠作为动力学实验的固定相捕获剂。




KinExA 可以用于检测:                   数据可用于:

完整真核细胞                                 FDA审评

纯化和未纯化分子                             新药审批申请

解离慢的高亲和力分子                         专利申请

活性浓度                                     基金申请

亲和力和动力学                               文章发表


三、KinExA的价值新药研发成本动辄数十上百亿美元,灵敏可靠的仪器在研发早期即可协助准确甄选苗头候选药物(hit),减少不必要的支出,降低研发风险。由于KinExA可在生理条件下获取准确可靠的结合常数,具有很高生物相关性,而且成本极低,目前被很多顶级制药公司用作主要的验证工具。此外,KinExA特有的分析软件可以轻松地解读候选分子的结合特征,节省研究人员的时间,增加结果的可靠性。


四、SPR的区别:SPR在芯片表面固定一个分子,通过芯片表明与溶液间二维相互作用的物质量改变而实现SPR检测。这就带来了非常显著的缺点:固定在芯片上的生物分子可能不能维持其天然活性、质量迁移影响动力学分析(例如,流速会影响实验结果)、被检测分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物结构其分子量有上限限制、样品需要纯化及无法检测完整细胞。

相反,KinExA分析三维水平及游离状态相互作用,不固定任何分子、不会对平衡带来影响、没有质量迁移的限制、可以检测未纯化样品和完整细胞;因此,极宽范围内的生物分子、生物结构及完整细胞均可灵活分析。”


五、KinExA  vs. SPR

1、与SPR的区别:SPR在芯片表面固定一个分子,通过芯片表明与溶液间二维相互作用的物质量改变而实现SPR检测。这就带来了非常显著的缺点:固定在芯片上的生物分子可能不能维持其天然活性、质量迁移影响动力学分析(例如,流速会影响实验结果)、被检测分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物结构其分子量有上限限制、样品需要纯化及无法检测完整细胞。

相反,KinExA分析三维水平及游离状态相互作用,不固定任何分子、不会对平衡带来影响、没有质量迁移的限制、可以检测未纯化样品和完整细胞;因此,极宽范围内的生物分子、生物结构及完整细胞均可灵活分析

2、与SPR技术的对比:为了表征治疗性单克隆抗体候选分子,研究者采用不同类型芯片,从Biacore系统获得同一组单抗-抗原的53组数据,与KinExA实验数据对比发现,亲和力及动力学数据与所使用的芯片类型有关,带负电荷的CM5,CM4及CM1芯片对Biacore的动力学数据有不利的影响。为了验证这一假设,作者通过Biacore液相实验,KinExA平衡态滴定以及KinExA动力学实验,精确计算抗体与抗原的亲和力及动力学参数。结果表明随着芯片表面负电荷的降低,亲和力及动力学参数与液相实验所得的结果越接近。可能的原因:(1)带负电荷的葡聚糖芯片与抗体之间的空间位阻影响抗原的结合;(2)带负电荷的抗原与芯片表面的负电荷静电排斥。


表中结果表明:对于Biacore技术,不同的固定方式(氨基偶联,捕获)以及不同的芯片,对实验结果均有明显影响。而采用KinExA技术,溶液中加葡聚糖,对结果也无明显影响。


图A,图B均采用KinExA技术检测。图A中buffer不含葡聚糖,KD=24.7pM;图B中buffer加入葡聚糖,KD=33.2pM。


图C,图D均采用Biacore技术检测。图C采用氨基偶联的方式CM5芯片固定抗体,KD=2.05nM;图D采用捕获的方式CM5芯片固定抗体,KD=2.86nM


六、案例

案例一:完整细胞的相互作用检测

<背景>:单克隆抗体XMetA是胰岛素受体(IR)变构部分的激动剂,其激活代谢Akt激酶信号通路,而对有丝分裂胞外信号调节激酶(ERK)信号通路几乎没有影响。为了研究这种选择性信号通路的性质,作者验证了XMetA对CHO细胞中IR,Akt和ERK的特异性磷酸化和活化的影响。

<目的>:完整细胞亲和力检测。

<方法>:研究者将表达短链型(IR-A)及长链型(IR-B)胰岛素受体的不同浓度CHO细胞分别与XMetA孵育,通过离心获得游离的XMetA,用KinExA仪器检测亲和力。另外,作者采取同样的策略,用KinExA仪器检测胰岛素与CHO细胞表面IR-A,IR-B的亲和力。

<结论>:XMetA与IR-A亚型的亲和力为55±16pM,与IR-B亚型的亲和力为50±11pM。另外,在对照抗体组,胰岛素与IR-A亚型的亲和力为156±14pM;在XMetA组,胰岛素与IR-A亚型的亲和力为216±100pM;在对照抗体组,胰岛素与IR-B亚型的亲和力为221±28pM;在XMetA组,胰岛素与IR-B亚型的亲和力为277±112pM。数据同时说明, XMetA与IR亚型的结合与胰岛素无关。



图A,图B通过KinExA技术检测胰岛素对XMetA与表达IR-A,IR-B的CHO细胞结合的影响;

图C,图D通过KinExA技术检测XMetA对胰岛素与表达IR-A,IR-B的CHO细胞结合的影响。


案例二:细胞与上清未纯化样品检测

<背景>:单克隆抗体(mAb)在体内与膜蛋白间亲和力的可靠评估是肿瘤治疗的主要问题。在BV展示系统中,膜蛋白能以天然状态在病毒表面展示。

<目的>:细胞与上清中未纯化样品亲和力检测。

<方法>:研究者基于KinExA技术,结合杆状病毒(BV)膜蛋白展示系统,描述了一个简单而高度敏感的单克隆抗体评估方法。

<结论>:在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上(BV beads),其KD值(~10pM)与全细胞分析方法一致(R2=0.998),表明基于KinExA技术检测方法提供了针对细胞表面蛋白的单克隆抗体亲和力准确的评估。




上图中显示的是KinExA实验中所使用的抗原。A图中可溶性Robo1用于标准的实验分析;B图中表达天然活性Robo1的CHO细胞用4%多聚甲醛固定,用于细胞分析实验;C图中表达天然活性Robo1的BV磁珠用于BV展示分析


下图采用KinExA技术检测抗Robo1抗体与抗原的亲和力。曲线上方的数字代表抗体的活性浓度。



七、仪器型号

1、KinExA 4000可以检测细胞(天然的和工程化的)、非纯化样品、血清样品,小分子等的相互作用和亲和力。 四个颗粒储存器可容纳四种不同的固相剂,并可与多达270个样品一起支持长时间的无人值守操作。 与其他生物传感器不同,KinExA能够测量生理相关条件下的相互作用。


2、KinExA 3100 / 3200 也是基于动态排阻分析技术开发的一种特殊性平台。仪器超高的灵敏性来源于其具有专利技术的流路,高质量的管路及超敏的光学系统。通过KinExA仪器能获得精确,灵敏,可靠的数据。


3、自动进样器使用灵活,可无人置守长时间操作多个实验,为KinExA仪器使用者提高工作效率。颗粒储存器能容纳四种不同的固相剂,可支持多达270个样品的自动操作。KinExA Pro软件用于实验程序的设计,可以设置开始检测时间以及孵育时间。


八、KinExA参考文献

1、2018年日本东京大学高级科学技术研究中心定量生物学和医学系Osamu Kusano-Arai等老师利用KinExA 3200 (Sapidyne Instruments Inc.)在《单克隆抗体在免疫诊断和免疫治疗中的应用(Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy)》上发表《对一种抗体可以识别CDH17上不同表位的免疫毒素混合物的胃癌细胞的协同细胞毒性影响》,该研究结果表明,以多种表位为靶点的免疫毒素复合物对低表达水平细胞具有协同作用,扩大了肿瘤免疫毒素治疗的适用范围。


2、2018年Eric S. Furfine博士等人利用KinExA 仪器 (Sapidyne Instruments Inc.)在《Eye & Contact Lens》上发表《EBI-005的临床前开发:一种IL-1受体-1抑制剂,用于眼表炎性疾病的局部治疗》,该研究对小鼠和兔的受体亲和力、药物生物利用度、免疫原性反应、安全性和耐受性进行了评估。


3、2017年Jonathan K. Fleming和Jonathan M. Wojciak利用KinExA 3200 (Sapidyne Instruments Inc.)在《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》上发表《测定1-磷酸鞘氨醇:动力学排斥试验的蛋白质相互作用》,由于缺乏固有的可追溯特性(如荧光或UV/Vis吸收),确定与溶磷脂结合的蛋白(如S1P)的准确、可靠的平衡解离常数的能力具有挑战性。通过共价键或衍生化修饰S1P可能改变蛋白质识别[1]的溶解性和/或自然模式。此外,由于S1P在水介质中表现出较差的溶解度特性,依赖于游离和结合S1P物种的物理分离的结合研究可能是困难的。然而,为了支持蛋白质的结构和功能,水介质是必需的。该文章中描述的KinExA方法克服了上面研究蛋白质-脂类相互作用的问题,并阐明了使用载体蛋白递送溶磷脂的效果。


4、2017年清华大学医学院基础医学部Hanqiu Zheng等老师利用KinExA 技术在《CellPress》上发表《治疗抗体靶向肿瘤和生态位衍生Jagged1使骨转移对化疗敏感》,作者报道了针对Jagged1(克隆15D11)的高效全人类单克隆抗体的发展。15D11除了对Jagged1表达的肿瘤细胞骨转移的抑制作用外,对化疗的骨转移也有明显的敏感性,诱导成骨细胞中Jagged1的表达,为癌细胞提供生存空间。使用了成骨细胞特异性的Jagged1转基因小鼠模型,作者进一步证实了骨母细胞Jagged1的骨转移功能。这些发现确立了15D11作为预防或治疗骨转移的潜在治疗药剂。


5、2007年清华大学化学工程系Feng-yi Su等老师利用KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc.)在《生物传感器与生物电子学(Biosensors and Bioelectronics)》上发表《基于流式动力学排斥荧光免疫分析,简单灵敏的细菌定量》,首次证明KinExA是细菌测定的可靠和有希望的替代方法。然而,与其他免疫测定方法一样,这种方法的可达到的最小检出限受到抗体与抗原的亲和性的限制。通过增加抗体对目标细菌的特异性,使用KinExA可以提高检测灵敏度,并且几乎没有交叉反应性的抗体在复杂群落中的细菌测定的应用中是潜在候选者。



KinExA部分参考文献

亲和力和动力学检测:

KinExA技术概述:

l Wani T.A., et al. 2016. New analytical application of antibody-based biosensor in estimation of thyroid-stimulating hormone in serum. Bioanalysis 10.4155/bio-2015-0034.

l Glass T.R., Winzor D.J. 2014. Conformation of the validity of the current characterization of immunochemical reactions by kinetic exclusion assay. Anal Biochem 456: 38-42. Bee C., et al. 2012. Exploring the dynamic range of the kinetic exclusion assay in characterizing antigen-antibody interactions. PLOS ONE 7(4): e36261.

l Darling R.J. and Brault P.A. 2004. Kinetic exclusion assay technology: characterization of molecular interactions. Assay and Drug Dev Tech 2(6): 647-657.

KinExA在药物研发中的作用:

l Danial M, et al. 2017.Site-Specific Polymer Attachment to HR2 Peptide Fusion Inhibitors against HIV-1 Decreases Binding Association Rates and Dissociation Rates Rather Than Binding Affinity. Bioconjug Chem. 10.1021/acs.bioconjchem.6b00540.

l Kariolis MS, et al. 2017. Inhibition of the GAS6/AXL pathway augments the efficacy of chemotherapies. J Clin Invest. 10.1172/JCI85610.

l Fan Y., et al. 2016. Immunological Characterization and Neutralizing Ability of Monoclonal Antibodies Directed Against Botulinum Neurotoxin Type H. The Journal of Infectious Diseases 15;213(10):1606-14.

l Köck, K., et al. 2015. Preclinical development of AMG 139, a human antibody specifically targeting IL-23. British Journal of Pharmacology 172:159-172.

l Tabrizi M.A., et al. 2009. Translational strategies for development of monoclonal antibodies from discovery to the clinic. Drug Discov Today 14(5/6): 298-305.

液相中检测非纯化样品:

l Tigue NJ, et al. 2017. MEDI1873, a potent, stabilized hexameric agonist of human GITR with regulatory T-cell targeting potential. Oncoimmunology.10.1080/2162402X.2017.1280645.

l Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem. 10.1016/j.ab.2016.04.004.

l Blake R.C., Li X., Blake D.A. 2007. Covalent and noncovalent modifications induce allosteric binding behavior in a monoclonal antibody. Biochemistry 46: 1573-1586.

SPR比较:

l Fleming JK, Wojciak JM. 2017. Measuring Sphingosine-1-Phosphate: Protein Interactions with the Kinetic Exclusion Assay. Methods Mol Biol. 10.1007/7651_2017_5.

l Abdiche YN. et al. 2016. Assessing kinetic and epitopic diversity across orthogonal monoclonal antibody generation platforms. MAbs. 10.1080/19420862.2015.1118596.

l Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem. 10.1016/j.ab.2016.04.004.

l Drake A.W., et al. 2012. Biacore surface matrix effects on the binding kinetics and affinity of an antigen/antibody complex. Anal Biochem. 429(1):58-69.

高亲和力检测:

l Abdiche YN. et al. 2016. Assessing kinetic and epitopic diversity across orthogonal monoclonal antibody generation platforms. MAbs. 10.1080/19420862.2015.1118596.

l Owyang A.M., et al. 2011. XOMA 052, a potent, high-affinity monoclonal antibody for the treatment of IL-1B-mediated diseases. mAbs 3(1): 49-60.

l Champagne K., Shishido A., Root M.J. 2009. Interaction of HIV-1 inhibitory peptide T20 with gp41 N-HR coiled coil. J Biol Chem 284: 3619-3627.

l Kostenuik P.J., et al. 2009. Denosumab, a fully human monoclonal antibody to RANKL, inhibits bone resorption and increases BMD in knock-in mice that express chimeric (murine/human) RANKL J Bone Miner Res 24: 182-195.

l Luginbuhl B., et al. 2006. Directed evolution of an anti-prion protein scFv fragment to an affinity of 1 pM and its structural interpretation. J Mol Biol 363: 75-97.

l Rathanaswami P., et al. 2005. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Comm 334: 1004-1013.

逆向检测:

l Razai A., et al. 2005. Molecular evolution of antibody affinity for sensitive detection of botulinum neurotoxin type A. J Mol Biol 351: 158-169.

完整细胞检测:

l Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

l Rathanaswami P., Babcook J., Gallo M. 2008. High-affinity binding measurements of antibodies to cell-surface-expressed antigens. Anal Biochem 373: 52-60.

l Xie L., et al. 2005. Measurement of the functional affinity constant of a monoclonal antibody for cell surface receptors using kinetic exclusion fluorescence immunoassay. J Immunol Methods 304: 1-14.

未纯化抗原检测:

l Wani T.A., et al. 2016. Analytical Application of Flow Immunosensor in Detection of Thyroxine and Triiodothyronine in Serum. Assay Drug Dev Technol.14(9):535-542.

l Bee C., et al. 2013. Determining the binding affinity of therapeutic monoclonal antibodies towards their native unpurified antigens in human serum. PLOS ONE 8(11): e80501.

l Fujino, Y., et al. 2012. Robust in vitro affinity maturation strategy based on interface-focuses high-throughput mutational scanning. Biochem Biophys Res Commun 4283:395-400.

l Rathanaswami P., et al. 2011. Kinetic analysis of unpurified native antigens available in very low quantities and concentrations. Anal Biochem 414: 7-13.

其他类型研究:

l Li X., Kaattari S.L., Vogelbein M.A., Vadas G.G., Unger M.A., 2016. A highly sensitive monoclonal antibody based biosensor for quantifying 3-5 ring polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in aqueous environmental samples. Sens Biosensing Res. 7:115-120.

l Lou J., et al. 2010. Affinity maturation of human botulinum neurotoxin antibodies by light chain shuffling via yeast mating. Protein Eng Des Sel 23(4): 311-319.

l Kahle K.M., Steger H.K., Root M.J. 2009. Asymmetric deactivation of HIV-1 gp41 following fusion inhibitor binding. PLOS Path 5(11): 1-11.

l Nowakowski A., et al. 2002. Potent neutralization of botulinum neurotoxin by recombinant oligoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci 99: 11346-11350.

免疫检测技术:

l Darwish I.A., et al. 2013. Kinetic-exclusion analysis-based immunosensors versus enzyme-linked immunosorbent assays for measurement of cancer markers in biological specimens. Talanta 111: 13-19.

l Prieto-Simon B., Miyachi H., Karube I., Saiki H. 2010. High-sensitive flow-based kinetic exclusion assay for okadaic acid assessment in shellfish samples. Biosens Bioelectron 25: 1395-1401.

l Sasaki K., Oguma S., Namiki Y., Ohmura N. 2009. Monoclonal antibody to trivalent chromium chelate complex and its application to measurement of the total chromium concentration. Anal Chem 81: 4005-4009.

l Glass T.R., Ohmura N., Saiki H. 2007. Least detectable concentration and dynamic range of three immunoassay systems using the same antibody. Anal Chem 79: 1954-1960.

l Bromage E.S., et al. 2007. The development of a real-time biosensor for the detection of trace levels of trinitrotoluene (TNT) in aquatic environments. Biosens Bioelectron 22: 2532-2538.

l Sasaki K., Glass T.R., Ohmura N. 2005. Validation of accuracy of enzyme-linked immunosorbent assay in hybridoma screening and proposal of an improved screening method. Anal Chem 77: 1933-1939.

l Glass T.R., et al. 2004. Use of excess solid-phase capacity in immunoassays: advantages for semicontinuous, near-real-time measurements and for analysis of matrix effects. Anal Chem 76: 767-772.

l Ohmura N., Lackie S., Saiki H. 2001. An immunoassay for small analytes with theoretical detection limits. Anal Chem 73: 3392-3399.



九、KinExA部分工业客户






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